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  • 脂质体2000转染法的详细操作步骤分享
  • 点击次数:658 发布时间:【2018-03-19】
  •    脂质体2000的转染操作步骤

      1、操作步骤[方法一]:

      (1)脂质体2000的转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入1mL不含血清培养液。

      (2)细胞培养:取6孔培养板(或用35mm培养皿),向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液,37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分,转染后不利筛选细胞)。

      (3) 转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液:用不含血清培养基稀释1-10μg DNA,终量100μL,B液:用不含血清培养基稀释2-50μgLR,终量100μL,轻轻混合A、B液,室温中置10-15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致,应酌情减量)。

      (4)转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。

      (5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

      注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。

      2、快速脂质体2000转染法操作步骤如下[方法二]:

      (1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时,使其达到50~60%板底面积。

      (2)在试管中配制DNA/脂质体2000复合物方法如下:

      ①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。

      ②旋转1秒钟,再加入脂质体2000悬液,旋转。

      ③室温下放置5~10分钟,使DNA结合在脂质体2000上。

      (3)弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物,37℃培养3~5小时。

      (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM,继续培养14~24小时,

      (5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培养24~48小时。

      (6)用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。

      3、稳定的脂质体转染方法如下:

      (1)接种细胞同前,细胞长至50%板底面积可用于转染。

      (2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。

      (3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培养48小时。

      (4)吸出DMEM,用G418选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。

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